METODE KROMATOGRAFI

A. Pendahuluan
1. Deskripsi Singkat
Bab ini akan membahas tentang metode kromatografi merupakan metode pemisahan yang paling sering dipakai serta luas dalam pemakainnya. Pemisahan kromatografi campuran lazim dilakukan dalam waktu relatif singkat dan tidak memerlukan peralatan yang terlalu mahal. Pengertian kromatografi meliputi berbagai proses pemisahan yang semuanya didasarkan atas distribusi diferensial komponen-komponen cuplikan antara dua fasa. Salah satu fasa tinggal tetap dalam sistem, dan dinamakan fasa diam atau stasioner. Fasa lainnya bergerak melalui pori-pori atau melewati permukaan fasa stasioner, fasa ini dinamankan fasa gerak atau fasa mobil.

2. Relevansi
Pembahasan materi dalam bab ini sangat erat kaitannya dengan bab sebelumnya maupun bab selanjutnya. Dalam bab ini mahasiswa akan memahami prinsip dasar pemisahan cara kromatografi serta berbagai jenis kromatografi yang digunakan dalam pemisahan kimia.

3. Tujuan
Setelah mempelajari bab ini mahasiswa diharapkan dapat :
1. Menguasai dan memahami prinsip dasar kromatografi
2. Menjelaskan jenis-jenis kromatografi
3. Menjelaskan prinsip dasar kromatografi gas
4. Menjelaskan prinsip dasar kromatografi cair-cair
5. Menjelaskan prinsip dasar elektroforesis.



B. Uraian
Hasil analsis kadang-kadang tidak dapat diandalkan jika sifat yang diukur tidak berhubungan spesifik dengan senyawa yang bersangkutan.Analisis bahan nyata atau riil, melibatkan sejumlah konstituen asing yang dapat mengganggu analisis konstituen yang diinginkan. Dalam hal ini atau dihilangkan dulu konstituen pengganggu atau konstituen yang diinginkan dipisahkan lebih dulu sebelum identifikasi dan penentuannya. Diantara berbagai teknik pemisahan yang tersedia, kromatografi merupakan metode pemisahan yang paling sering dipakai serta luas dalam pemakainannya. Pemisahan kromatografik campuran lazim dilakukan dalam waktu relatif singkat dan tidak memerlukan peralatan yang terlalu mahal.
Kromatografi diperkenalkan pertama kali oleh Tswett (1906) seorang ahli botani dari Rusia. Pada percobaannya ia tempatkan campuran klorofil dalam pelarut organik pada ujung atas kolom yang terbuat dari bubuk kalsium karbonat yang ditempatkan dalam tabung gelas. Kolom ini dialiri dengan pelarut organik dan menghasilkan pemisahan pigmen-pigmen menjadi berbagai pita-pita berwarna. Ia mampu memisahkan masing-masing pita berwarna untuk keperluan identifikasi dan analisis kuantitatif pigmen tersebut. Menurut Tswett, pemisahan menjadi berbagai pita-pita berwarna disebabkan karena pigmen yang terserap kuat mendesak keluar pigmen yang terserap kurang kuat. Adanya pita-pita berwarna menyarankan istilah kromatografi.
Pengertian kromatografi kini meliputi berbagai proses pemisahan yang semuanya didasarkan atas distribusi diferensial komponen-komponen cuplikan antara dua fasa. Salah satu fasa tinggal tetap dalam sistem, dan dinamakan fasa diam atau stasioner. Fasa lainnya bergerak melalui pori-pori atau melewati permukaan fasa stasioner, fasa ini dinamankan fasa gerak atau fasa mobil. Gerakan fasa mobil melibatkan migrasi diferensial komponen-komponen dalam cuplikan.
Kromatografi dapat disamakan dengan ekstraksi arus berlawanan Craig, kedua metoda ini memakai dua fasa. Pada metoda Craig, salah satu fasa bergerak relatif terhadap fasa lainnya sedangkan pada metoda kromatografi fasa mobil bergerak secara terus-menerus. Pada setiap titik dalam kolom, terjadi kesetimbangan cepat antara kedua fasa, meskipun jarang berlangsung sempurna. Peralatan yang diperlukan pada proses Craig sangat rumit sedangkan untuk proses kromatografi dapat dipakai peralatan relatif sederhana, seperti misalnya buret terisi sebagian dengan kolom pemisah, atau lempeng kaca dalam gelas piala. Proses Craig, terbatas pada pemakaian dua pelarut yang tidak bercampur satu sama lain sedangkan pada proses kromatografi dapat dipakai beberapa jenis fasa.
5.1. Prinsip-prinsip Dasar
5.1.1 Jenis Kromatografi
Ada berbagai cara penggolongan teknik kromatografi, pertama berdasarkan perbedaan teknik pengerjaan, dikenal kromatografi elusi, partisi dan pendesakan. Kedua, berdasarkan jenis fasa yang dipakai (mobil-stasioner), yaitu a) kromatografi gas-cair b) kromatografi gas-padat, c) kromatografi cair-cair, d) kromatografi cair-padat.
Umumnya metoda kromatografi digolongkan sebagian berdasarkan jenis fasa yang dipakai dan sebagian lagi berdasarkan mekanisme distribusi fasa. Dengan demikian dikenal :
1. Kromatografi cair-padat atau kromatografi adsorpsi, dipakai dalam analisis biokimia dan organik. Sebagai bahan kolom dipakai atau alumina atau silika. Metoda ini sangat terbatas pada pemilihan bahan adsorpsi. Batasan lain adalah karena koefisien difusi untuk adsorpsi seringkali bergantung pada konsentrasi total, sifat ini mengakibatkan hasil pemisahan yang tak sempurna.
2. Cair-cair atau kromatografi partisi. Fasa diam berupa lapis tipis cairan terserap pada permukaan padatan inert berpori. Pilihan gabungan fasa cair cukup banyak, dan koefisien distribusi sistem-sistem ini tidak bergantung pada konsentrasi, sehingga hasil-hasil pemisahan menjadi lebih tajam.
3. Kromatografi gas-padat, dipakai mula-mula untuk memurnikan gas, metoda ini mengalami banyak hambatan tetapi riset baru dengan jenis-jenis baru padatan memungkinkan pemakaian dengan baik metoda ini.
4. Kromatografi gas-cair, kadang-kadang juga dinamakan kromatografi fasa uap oleh pakar organik. Metoda ini paling banyak dipakai dalam pemisahan. Cuplikan yang dipakai dapat bervariasi antara beberapa mikrogram sampai dengan 100 gram, renik dengan ukuran sampai dengan 10-15 gram masih dapat dideteksi. Halangan yang masih ada adalah bahwa komponen cuplikan harus bertekanan uap beberapa torr pada temperatur kolom.
5. Kromatografi ion penukar, merupakan bidang khusus kromatografi cair-padat. Metoda ini terutama ditujukan terhadap spesies ion, dan penemuan resin sintetik sangat membantu kemajuan dalam metoda kromatografi ini.
6. Kromatografi kertas, adalah bidang khusus dalam kromatografi cair-cair, dimana fasa diam berupa lapisan air terserap pada matriks kertas, selain air dapat juga dipakai jenis pelarut lain. Metoda ini sangat sederhana dalam pengerjaannya. Hanya diperlukan penempatan satu tetes larutan cuplikan pada ujung kertas, kemudian mencelupkan ujung ini ke dalam pelarut elusi.
7. Kromatografi lapis tipis, sama dengan kromatografi kertas hanya saja kertas diganti dengan lapis tipis kaca atau plastik yang dilapisi dengan selapis tipis alumina, silika atau materi lain dalam bentuk serbuk halus. Sifat lapis tipis ini lebih reprodusibel dibandingkan dengan kertas, karena itu metode lapis tipis ini mampu mengganti kedudukan kromatografi kertas di laboratorium.
8. Filtrasi Jel, merupakan proses pemisahan yang dilakukan dengan jel terdiri atas dekstran yang dimodifikasi. Jaringan tiga dimensional molekul polisakarida linier yang telah berikatan silang. Bahan ini menggelembung dalam air, dan membentuk saringan dengan ukuran pori tertentu, pori-pori ini menahan molekul-molekul dengan ukuran sesuai dengan ukuran pori-porinya. Disamping efek geometrik, terlibat juga efek permukaan pada proses pemisahan ini.
9. Elektroforesis kontinu adalah proses kromatografi kertas, dan selama pengerjaannya diterapkan medan elektrik tegak lurus pada aliran pelarut. Spesies ionik akan menyimpang dari arah semula bergantung pada muatan dan mobilitasnya.
5.1.2. Teori Dasar Kromatografi
Teori dasar kromatografi pertama kali dikembangkan untuk kromatografi cair-cair oleh Martin dan Synge. Teori dasar ini kemudian diperbaiki dan diperhalus untuk dapat dipakai pada kromatografi gas-cair; meskipun demikian prinsip-prinsip dasar dapat dipakai untuk berbagai macam metoda kromatografi.
Jika suatu molekul cuplikan mengikuti proses kromatografik, dapat diamati bahwa dalam fasa diam, molekul ini tidak bergerak, dan baru bergerak maju apabila masuk dalam fasa mobil, seperti terlihat pada gambar berikut ;


Gambar 5.1 Potongan kolom kromatografi
Fasa mobil bertindak sebagai pembawa (berupa lapis atas dan fasa diam berupa fasa diam)
Jika keterangan tersebut di atas diterapkan terhadap kromatografi elusi, akan dia amati bahwa mula-mula cuplikan yang misalnya terdiri atas komponen A dan B, dilarutkan dalam fasa gerak, kemudian diisikan pada ujung atas kolomyang telah diisi dengan fasa diam. Di tempat awal ini baik A maupun B sudah mendistribusikan diri antara fasa diam dan fasa gerak. Penambahan lebih lanjut fasa gerak akan memaksa cuplikan terlarut bergerak ke bawah sepanjang kolom, setiap kali menemui porsi baru fasa diam A dan B mengalami partisi antara fasa diam dan fasa gerak. Komponen baru akan maju lebih lanjut jika ia terdapat dalam fasa gerak; laju migrasi rata-rata tiap komponen ditentukan oleh fraksi waktu tersedia untuknya dalam fasa tersebut. Fraksi waktu ini akan kecil bagi komponen yang terserap kuat dalam fasa diam, dan besar bagi komponen yang lebih sering terdapat dalam fasa gerak. Karena fraksi waktu untuk menetap dalam fasa gerak tidak sama untuk tiap komponen, terjadi perbedaan dalam laju migrasi; diharapkan komponen-komponen dalam campuran saling memisahkan diri dalam bentuk pita sepanjang kolom. Dengan penambahan kuantitas fasa gerak (eluen) cukup banyak ke dalam kolom, akan mengakibatkan masing-masing pita keluar satu demi satu dari kolom untuk keperluan penampungan. Jika pada ujung kolom ditempatkan sebuah detektor dapat diketahui komponen mana yang akan keluar lebih dulu, pengaluran konsentrasi komponen terhadap waktu menghasilkan grafik yang dinamakan kromatogram. Kromatogram ini berguna untuk keperluan analisis baik kualitatif maupun kuantitatif.
5.1.3. Laju Migrasi Komponen
Keefektifan kolom kromatografi memisahkan campuran komponen sebagian bergantung pada laju ini ditentukan oleh nilai pembanding partisi tiap komponen antara kedua fasa. Untuk sebuah komponen atau solut A, misalnya, kesetimbangan antara kedua fasa dapat dinyatakan dengan Amobil A stasioner
Tetapan kesetimbangan K didefenisikan sebagai,
K = Cs/Cm .............................................. (1)
dengan Cs dan Cm dimaksudkan konsentrasi analitik dalam fasa stasioner dan fasa diam, K dinamakan pembanding partisi atau dinamakan juga koefisien partisi. Kondisi pengerjaan harus sedemikian rupa sehingga harga K praktis tetap dalam jangkauan konsentrasi cukup lebar.
Dengan waktu retensi, tR, dimaksudkan jumlah waktu yang diperlukan sebuah solut untuk keluar dari kolom (dan mencapai detektor).





Gambar 5.2 Kromatogram A

tM menggambarkan waktu retensi spesies yang tidak ditahan oleh kolom, laju migrasi spesies ini adalah sama untuk laju rata-rata molekul fasa gerak.
Rata-rata laju linier solut adalah v = L/tR dengan L sebagai panjang kolom. Hubungan antara waktu retensi dan pembanding partisi dapat dicari sebagai berikut :
Jika rata-rata laju linier fasa gerak adalah u = L/tM, maka v = u x fraksi waktu solut dalam fasa mobil. Fraksi waktu ini adalah sama dengan perbandingan jumlah mol solut dalam fasa mobil terhadap jumlah total mol solut dalam kolom dan di dapat





dengan Cm dan Cs berturut-turut konsentrasi molar solut dalam fasa mobil dan fasa stasioner, Vm dan Vs adalah volum masing-masing fasa dalam kolom. Jika persamaan 1 dimasukkan dalam persamaan terakhir didapat ungkapan laju migrasi solut sebagai fungsi dari baik pembanding partisi maupun volum fasa mobil dan diam.
.................................. (2)
kedua volum dapat diperkirakan dari metoda persiapan kolom.
Untuk menggambarkan laju migrasi solut dalam kolom lazim dipakai faktor kapasitas, yang untuk solut A didefenisikan sebagai,
k’A = KAVs/Vm
dengan KA sebagai pembanding partisi A diantara kedua fasa. Jika ungkapan ini dimasukkan dalam persamaan (2) di dapat,
dan setelah penyusunan ulang diperoleh,
............................ (3)
tR dan tm dapat dihitung dari kromatogram. Jika faktor kapasitas untuk suatu solut jauh lebih kecil dari satu, elusi berlangsung sedemikian cepat, sehingga penentuan waktu retensi menjadi sangat sulit. Jika faktor kapasitas lebih besar dari 20 sampai 30, waktu elusi menjadi amat panjang. Umumnya pemisahan dilakukan dengan memakai kondisi pengerjaannya yang menghasilkan nilai faktor kapasitas antara 1 sampai 5. dalam kromatografi gas, nilai faktor kapasitas dapat diatur dengan mengubah temperatur dan fasa diam dalam kolom. Dalam kromatografi cairan, pengaturan faktor kapasitas untuk menghasilkan pemisahan yang lebih baik dilakukan dengan mengubah komposisi fasa mobil dan fasa stasioner.
Faktor selektivitas kolom untuk dua spesies A dan B, dinyatakan sebagai,
......................................... (4)
dengan KB sebagai pembanding partisi spesies B yang lebih sukar terelusi, dan KA adalah pembanding partisi spesies A yang lebih mudah terelusi. Berdasarkan defenisi ini harga  harus selalu lebih besar dari satu. Hubungan antara faktor selektivitas kedua solut dan faktor kapasitas dinyatakan sebagai,
......................................... (5)
dimana k’B dan k’A adalah faktor kapasitas untuk masing-masing solut B dan A. Untuk menentukan harga  dari kromatogram dipakai rumus : .
5.1.4. Bentuk Pita dan Pelebaran Pita
Pada kromatogram pita berbentuk puncak mirip dengan kurva Gauss (lihat Gambar 5.2). Bentuk ini didapat sebagai hasil penjumlahan gerakan acak sejumlah besar partikel solut pada saat pita kromatografik bergerak sepanjang kolom.
Sebuah molekul solut yang bergerak sepanjang kolom, mengalami sejumlah besar perpindahan antara fasa mobil dan fasa stasioner. Waktu keberadaannya dalam setiap fasa sangat tak teratur. Perpindahan antara fasa memerlukan energi dan molekul mengambil energi ini dari lingkungannya. Ini berarti bahwa waktu tinggal dalam fasa tertentu tidak menentu, kadang-kadang pendek atau mungkin sangat lama. Ingat bahwa molekul hanya akan bergerak jika terdapat dalam fasa mobil. Berdasarkan keterangan ini, ada partikel yang dapat bergerak cepat tetapi ada juga partikel yang bergerak amat lambat, karena terlalu lama ada dalam fasa stasioner. Hasil acak masing-masing proses ini menimbulkan sebaran simetrik kecepatan disekitar harga rata-rata. Lebar pita akan meningkat selama gerakan sepanjang kolom karena adanya alokasi waktu lebih banyak untuk menghasilkan pelebaran. Dengan demikian lebar pita berhubungan lurus dengan waktu tinggal dalam kolom dan berhubungan terbalik terhadap laju alir fasa mobil.
Efisiensi kolom kromatografik ditentukan oleh dua parameter, yaitu ; a) jumlah lempeng teoretis, N, dan b) tinggi lempeng, H, (juga dinamakan tinggi setara dengan lempeng teoretis, HETP). Hubungan antara kedua parameter ini diberikan oleh N = L/H, dengan L adalah panjang kolom. Makin besar harga N, makin kecil harga H dan keefektifan kolom akan meningkat.
Penentuan harga N dan H dapat dilakukan dengan mengamati kromatogram yang dihasilkan. Untuk setiap puncak dapat ditentukan harga tR dan lebar dasar puncak, W. Dengan mengetahui panjang kolom, L dapat dihitung hartga H berdasarkan rumus,
..................................... (6)
Dan karena N = L/H maka didapat,

N = 16 (tR/W)2................................ (7)

Metoda lain hitungan N didasarkan atas penentuan lebar puncak setengah ketinggian puncak, W1/2 dan hitungan untuk N menjadi,

N = 5,54 (tR/ W1/2)2 ....................... (8)

Untuk menerangkan proses kromatografik dapat dipakai atau a) teori laju reaksi atau kinetik dan b) teori lempeng. Dengan teori kinetik dapat dijelaskan peristiwa a) laju migrasi diferensial solut, b) bentuk Gauss puncak kromatografik dan c) pelebaran puncak. Sedangkan teori lempeng hanya mampu menjelaskan bentuk Gauss puncak serta faktor-faktor berpengaruh pada perbedaan dalam migrasi solut. Teori ini tidak mampu menjelaskan peristiwa pelebaran puncak. Disamping ini teori lempeng memberi kesan bahwa kolom kromatografik dapat dianggap terdiri atas sejumlah besar lapisan atau lempeng, dalam mana dapat diberlakukan kondisi kesetimbangan.
Berbagai usaha telah dilakukan untuk menerangkan peristiwa pelebaran puncak, dan sejumlah persamaan matematik telah diajukan. Paling terkenal adalah persamaan van Deemter yang dipakai untuk menentukan efisiensi kolom kromatografi, yaitu ;
H = A + B/u + Cu
persamaan mana telah diperbaiki menjadi,

H = B/u + Csu + Cmu
Dengan ;
H = tinggi lempeng dalam Cm
B = koefesien difusi longitudinal
Cs = koefisien perpindahan massa fasa diam
Cm = koefisien perpindahan massa fasa mobil
u = laju linier fasa mobil dalam cm/detik
dengan mempelajari pengaruh masing-masing faktor terhadap gerakan solut dalam kolom dapat dimengerti terjadinya pelebaran puncak dan dapat dilakukan pengaturan kondisi pengerjaan untuk mendapatkan kromatogram yang baik. Pengaturan kondisi pengerjaan dilakukan untuk mendapatkan pemisahan maksimal antara dua komponen dalam waktu pengerjaan sesingkat mungkin.
Resolusi. Rs menggambarkan ukuran kuantitatif kemampuan kolom untuk memisahkan dua komponen. Untuk setiap kolom resolusi didefenisikan sebagai,

....................................... (10)
Resolusi untuk fasa diam tertentu dapat diperbaiki dengan menambah panjang kolom dan sekaligus memperbanyak jumlah lempeng, tetapi sebaliknya menambah waktu yang diperlukan untuk menghasilkan resolusi. Untuk menghasilkan resolusi tertentu dapat dihitung jumlah lempeng, N yang diperlukan berdasarkan rumus,

....................................... (11)
dengan α sebagai faktor selektivitas dan k’B faktor kapasitas spesies yang bergerak lebih lambat.
Contoh soal. Senyawa A dan B mempunyai waktu retensi 16, 40 dan 17,63 menit pada kolom 30,0 cm. Spesies yang tidak ditahan oleh kolom melewati kolom dalam waktu 1,30 menit. Lebar dasar masing-masing puncak A dan B adalah 1,11 dan 1,21 menit. Hitung a) resolusi kolom, b) rata-rata lempeng dalam kolom, c) tinggi lempeng, panjang kolom untuk menghasilkan resolusi 1,5 dan e) waktu yang diperlukan untuk elusi senyawa B pada kolom yang lebih panjang.
Solusi a) dengan memakai persamaan (10) dapat dihitung = 1,06
b) = 3493 dan = 3397

c) H = L/N = 30,0/3445 = 8,7.10-3 cm
d) k’ dan α tidak terpengaruh oleh kenaikan N dan L sehingga di dapat, (Rs)1/(Rs) = = 1,06/1,5 dan N2 = 6,9.103 tetapi L = NH dan L = 60 cm.
e) dari 17,63/tR = (1,06/1,5)2 di dapat tR = 35 menit untuk kolom yang lebih panjang.

Kromatografi dapat dipakai baik pada analisis kualitatif maupun kuantitatif. Untuk analisis kualitatif perlu diketahui harga tR masing-masing solut pada kondisi pengerjaan, sedangkan dalam analisis kuantitatif perlu diketahui atau tinggi puncak atau luas puncak yang dibandingkan terhadap satu atau lebih zat baku atau standar.

5.2. Kromatografi Gas
Pada kromatografi gas, sebagai fasa mobil dipakai gas inert atau lamban yang berfungsi sebagai gas pembawa, dan komponen-komponen cuplikan akan terelusi dari kolom berisi fasa stasioner. Berbeda dengan kromatografi cair, pada kromatografi gasw tidak terjadi interaksi antara analit dengan fasa mobil; laju gerakan tidak bergantung pada sifat kimia fasa mobil.
Sebagai fasa stasioner dalam kromatografi gas-padat dapat dipakai padatan yang mempunyai luas permukaan besar, pada permukaan mana dapat berlangsung adsorbsi spesies analit. Terjadinya pemisahan disebabkan karena adanya perbedaan dalam kedudukan kesetimbangan adsorbsi antara komponen-komponen cuplikan dalam fasa gas dan permukaan padatan fasa stasioner. Pemakaian kromatografi gas-padat terbatas pada pemisahan spesies gas dengan massa relatif rendah seperti misalnya gas karbon monoksida, oksigen, nitrogen dan beberapa hidrokarbon.
Kromatografi gas-cair merupakan salah satu metoda penting dan terpakai luas untuk memisahkan dan menentukan komponen-komponen kimia dalam campuran kompleks. Pada teknik pemisahan ini, sebagai fasa stasioner dipakai cairan yang terserap atau terikat secara kimia pada permukaan padatan pendukung. Laju gerakan ditentukan oleh pembanding distribusi antara fasa gas dan fasa cair yang dibuat tidak bergerak.

a. Dasar-dasar Kromatografi Gas.
Konsep dasar yang telah dibahas sebelumnya dapat dipakai dalam kromatografi gas. Persamaan untuk tinggi lempeng dapat dipakai baik untuk kromatografi gas maupun cair. Pada kromatograf, gas perlu diperhatikan faktor difusi longitudinal, B/u, mengingat dipakainya gas sebagai fasa mobil, karena laju difusi dalam fasa ini pada umumnya 104 kali lebih besar jika dibandingkan dengan laju difusi dalam fasa cair.

b. Peralatan Dasar
Gambar berikut menunjukkan komponen dasar dalam peralatan.






Gambar 5.3 Kromatografi Gas

Sebagai gas pembawa dapat dipakai gas helium, argon, nitrogen dan hidrogen. Umumnya jenis gas yang dipakai disesuaikan dengan macam detektor yang dipakai. Tabung gas dilengkapi dengan peralatan pengatur tekanan, penunjuk alir gas. Juga dilengkapi dengan saringan molekuler untuk menghilangkan air dan pengotor lain.
Sistem injeksi diperlukan, karena cuplikan cukup diberikan dalam jumlah amat sedikit, berbentuk ”sumbat” uap atau gas. Baik sistem injeksi maupun kolom dan detektor, ”disimpan” dalam sebuah termostat untuk memudahkan pengaturan temperatur.
Ada dua macam kolom yang dapat dipakai, packed atau kolom yang sudah diisi, dan tubular atau kolom kapiler terbuka.
Kolom terisi berupa kolom terbuat dari kaca atau logam dengan panjang 2 sampai 3 m dan bergaris tengah 2 sampai 4 mm. Kolom ini sudah diisi dengan bahan fasa stasioner, berupa a) bahan pendukung anorganik yang telah dilapisi dengan cairan organik, dan b) bahan polimer organik berpori yang tidak memerlukan pelapisan.
Kolom kapiler terbuka, berupa kapiler kaca atau silika dengan bagian dalam dinding kapiler dilapisi dengan selapis tipis bahan fasa stasioner.
Detektor yang dipakai harus mampu mendeteksi dengan segera konsentrasi renik solut pada saat mereka keluar dari kolom. Ada tiga macam detektor umum dipakai pada kromatograf gas, a) detektor hantaran termal, atau thermal conductivity detector,b) detektor ionisasi nyala, atau flame ionization detector dan c) detektor penangkap elektron, atau elektron-capture detector.
Kromatografi gas sering digabung dengan teknik selektif spektroskopi dan elektrokimia. Pemakaian detektor spektroskopik dan elektrolitik memungkinkan analisis kontinu efluen kolom, untuk keperluan ini dipakai peralatan yang dilengkapi dengan komputer.

5.3. Kromatografi Cair-cair
Kromatografi cair-cair umumnya dilakukan dalam kolom dengan fasa cair sebagai fasa mobil. Pada teknik pemisahan ini dapat dibedakan empat macam metoda : a) partisi atau kromatografi cair-cair, b) adsorbsi atau kromatografi cair-padat, c) kromatografi ion penukar dan d) kromatografi permeasi jel.
Pengerjaan mula kromatografi cair memakai kolom terbuat dari kaca bergaris tengah 1 sampai 5 cm dan panjang kolom 50 sampai 500 cm. Agar laju alir tidak terlalu kecil; dipakai partikel padatan berukuran 150 sampai 200 m. Dengan memakai ukuran sekecil ini laju alir terbatas hanya beberapa sepersepuluh ml per menit. Waktu pemisahan juga amat panjang atau lama, berkisar antara beberapa jam.
Untuk meningkatkan efisiensi kolom dipakai partikel halus berukuran sekitar 10 m, pemakaian partikel sehalus ini memerlukan tambahan peralatan berupa antara lain sistem pompa canggih yang mampu menghasilkan tekanan sampai beberapa ratus psi.
Kolom yang dipakai terbuat dari bahan anti karat atau kaca berdinding tebal untuk menahan tekanan sampai maksimal 600 psi. Panjang kolom antara 10 hingga 30 cm dan bergaris tengah (sebelah dalam) 4 sampai 10 mm. Ukuran partikel yang dipakai berkisar antara 5 sampai 10 m tetapi ada juga kolom yang memakai ukuran partikel antara 3 sampai 5 m. Untuk bahan partikel dipakai silika yang kemudian dilapisi dengan selapis tipis bahan organik teradsorbsi atau terikat secara kimia pada permukaan bahan. Bahan lain yang juga dapat dipakai adalah alumina, bahan polimer berpori dan resin penukar ion.
Kromatografi cair memerlukan sistem pompa yang baik memenuhi persyaratan : a) mampu menghasilkan tekanan sampai dengan 6000 psi (pounds per square inch), b) menghasilkan tekanan kontinu dan bebas dari denyut, c) menghasilkan laju alir 0,1 sampai 10 ml/menit dan d) tahan terhadap korosi karena pemakaian bermacam pelarut.
Untuk memasukkan cuplikan dipakai sistem sampling loops atau lingkaran sampel. Sistem ini menjamin tidak terputusnya aliran selama memasukkan cuplikan.
Jenis detektor umum dipakai pada teknik kromatografi ini adalah detektor yang menyerap radiasi ultralembayung atau sinar tampak. Jenis detektor lain yang juga dapat dipakai adalah yang mampu mendeteksi perubahan indeks bias dalam pelarut atau detektor yang mengamati sifat elektrokimia larutan yang keluar dari kolom.
Bahan untuk fasa stasioner dapat juga berupa resin penukar ion, pada prosedur pemisahan ini, ion-ion dengan muatan sama dipisahkan dengan cara elusi dari kolom berisi resin yang berbentuk bubuk halus. Resin penukar ion umumnya tidak larut dalam air dan reaksi penukaran dapat digambarkan sebagai berikut ;

XRSO3- H+ (s) + Mx+ (aq) (RSO3-)x Mx+(s) + XH+ (aq)
XRN(CH3)3+OH- (s) + Ax+ (aq) (R N(CH3)3+)3 Ax-(s) + XOH- (aq)
dengan R berupa bagian resin yang mengandung satu gugus sulfonik (resin penukar kation) atau satu gugus basa amin dalam resin penukar anion. Dalam larutan, kesetimbangan penukaran ini cepat berlangsung antara fasa padatan dan fasa larutan.

5.3.1 Kromatografi Planar
Metoda kromatografik planar meliputi kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas. Setiap metoda ini memerlukan lapis tipis materi berbentuk bidang datar, yang dapat langsung dipakai untuk pemisahan atau harus dilapiskan di atas lempeng kaca atau plastik, atau logam. Fasa mobil bergerak melalui fasa stasioner berdasarkan kerja kapiler kadang-kadang dibantu tarikan gravitasi atau potensial elektrik.
Kromatografi planar kini terutama didasarkan atas teknik lapis tipis yang mampu bekerja lebih cepat, memberi resolusi lebih baik dan lebih peka dibandingkan dengan kromatografi kertas.
Kromatografi lapius tipis dilakukan pada lempeng kaca yang dilapisi dengan selapis tipis partikel-partikel halus. Lapis tipis ini berfungsi sebagai fasa stasioner.
Dengan pengembangan lempeng dimaksudkan proses dimana cuplikan dibawa oleh fasa mobil melalui fasa stasioner; proses ini sama dengan proses elusi dalam kromatografi cair. Teknik pengerjaan adalah sebagai berikut; tempatkan setetes larutan cuplikan di atas lapis tipis, dekat salah satu ujung lapis tipis; beri tanda yang jelas. Uapkan pelarut dan tempatkan lapis tipis ini di dalam wadah tertutup yang sudah terisi dengan fasa mobil. Usahakan agar tempat tetes cuplikan tidak tercelup dalam fasa mobil, lihat gambar berikut. (Gambar 5.4)





Gambar 5.4 Kromatografi Lapis Tipis
Setelah larutan pengembang merayap sejauh setengah atau dua per tiga bagian panjang lempeng, lempeng dikeluarkan dari dalam wadah dan dikeringkan. Posisi masing-masing komponen dapat ditentukan kemudian memakai cara-cara penentuan tertentu.
Untuk keperluan analisis kualitatif harus dicari harga Rf masing-masing noda (komponen) untuk dibandingkan terhadap harga Rf senyawa baku.



Penentuan Rf : A = x/h B = y/h
Teknik pengerjaan ini hanya dapat dipakai untuk penentuan semikuantitatif; luas noda yang didapat dibandingkan terhadap luas noda zat yang sama tetapi telah diketahui kuantitasnya. Cara lebih baik adalah noda yang didapat dilepaskan dari lempeng, esktraksi senyawa bersangkutan dari padatan dan menentukan kadar senyawa memakai salah satu cara penentuan yang lazim.
Kromatografi kertas dikerjakan dengan cara yang sama; sebagai lempeng dipakai kertas terbuat dari selulosa dengan kemurnian amat tinggi dan pengaturan ketat tebal dan besar pori kertas. Kertas macam ini mengandung air cukup banyak untuk menghasilkan lapisan air sebagai fasa stasioner.

5.4. Elektroforesis
Elektroforesis ditujukan pada pengangkutan partikel bermuatan dalam medan elektrik. Ini adalah salah satu bentuk kromatografi, perbedaan dalam laju migrasi dapat dipakai untuk memisahkan protein, polisakarida dan asam-asam nukleik dan sekaligus menentukannya.
Fasa cair dapat berupa larutan dalam tabung U atau berupa lapis tipis pada kertas atau pada pendukung berpori.
Untuk pengerjaannya dilakukan sebagai berikut. Pita kertas saring diletakkan di atas lempeng kaca datar; kedua ujung kertas dicelupkan dalam larutan buffer. Larutan cuplikan diteteskan di tengah kertas sedangkan masing-masing elektroda ditekankan pada tiap ujung kertas. Jika diberi arus listrik, komponen cuplikan akan bergerak ke salah satu elektroda, dan menghasilkan kumpulan noda-noda. Dengan mengamati letak masing-masing noda dapat dilakukan analisis kualitatif dan analisis kuantitatif.
C. Latihan
Senyawa A dan B mempunyai waktu retensi 13, 40 dan 15,33 menit pada kolom 30,0 cm. Spesies yang tidak ditahan oleh kolom melewati kolom dalam waktu 1,10 menit. Lebar dasar masing-masing puncak A dan B adalah 1,10dan 1,20 menit. Hitung a) resolusi kolom, b) rata-rata lempeng dalam kolom, c) tinggi lempeng, panjang kolom untuk menghasilkan resolusi 1,5 dan e) waktu yang diperlukan untuk elusi senyawa B pada kolom yang lebih panjang.
D. Petunjuk Soal Latihan
Untuk menjawab soal latihan, pelajari contoh soal yang sudah disajikan dalam uraian bab ini. Pergunakan persamaan (10) dan (11).

E. Rangkuman
Pengertian kromatografi meliputi berbagai proses pemisahan yang semuanya didasarkan atas distribusi diferensial komponen-komponen cuplikan antara dua fasa. Salah satu fasa tinggal tetap dalam sistem, dan dinamakan fasa diam atau stasioner. Fasa lainnya bergerak melalui pori-pori atau melewati permukaan fasa stasioner, fasa ini dinamankan fasa gerak atau fasa mobil. Gerakan fasa mobil melibatkan migrasi diferensial komponen-komponen dalam cuplikan.
Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh Michael Tsweet(1906). Ada berbagai cara penggolongan teknik kromatografi, pertama berdasarkan perbedaan teknik pengerjaan, dikenal kromatografi elusi, partisi dan pendesakan. Kedua, berdasarkan jenis fasa yang dipakai (mobil-stasioner), yaitu a) kromatografi gas-cair b) kromatografi gas-padat, c) kromatografi cair-cair, d) kromatografi cair-padat. Umumnya metoda kromatografi digolongkan sebagian berdasarkan jenis fasa yang dipakai dan sebagian lagi berdasarkan mekanisme distribusi fasa. Dengan demikian dikenal : Kromatografi cair-padat atau kromatografi adsorpsi, Kromatografi cair-cair atau kromatografi partisi, Kromatografi gas-padat, Kromatografi gas-cair, Kromatografi ion penukar, Kromatografi kertas, Kromatografi lapis tipis, Filtrasi Jel dan Elektroforesis kontinu.
F. Tes Formatif
1. Jelaskan prinsip dasar yang mendasari metode kromatografi?
2. Jelaskan jenis-jenis kromatografi?
3. Jelaskan teori dasar kromatografi.
4. Apa yang dimaksud dengan koefisien partisi, waktu retensi, faktor kapasitas dan resolusi.
5. Jelaskan apa yang dimaksud dengan elektroforesis.
[[
G. Umpan Balik dan Tindak Lanjut
Untuk mengetahui tingkat keberhasilan anda dalam menjawab soal-soal yang ada, bandingkan hasil jawaban anda dengan kunci jawaban dibagian akhir modul ini. Hitunglah jawaban yang benar, kemudian gunakan rumus di bawah untuk mengetahui tingkat penguasaan anda terhadap materi ini, rumus :

Tingkat Penguasaan = Jumlah jawaban yang benar x 100 %
Jumlah soal tes formatif

Arti tingkat penguasaan yang anda capai ;
90 % - 100 % = Baik Sekali
80 % - 90 % = Baik
70 % - 80 % = Sedang
< 69 % = Kurang
Jika anda mencapai tingkat penguasaan 80 % ke atas. Anda dapat melanjutkan kegiatan belajar selanjutnya. Tetapi jika tingkat penguasaan anda masih dibawah 80 % sebaiknya anda mengulang kegiatan belajar ini dengan sungguh-sungguh, terutama bagian yang anda belum anda kuasai.
H. Jawaban tes formatif
1. Semua metode Kromatografi didasarkan atas distribusi diferensial komponen-komponen cuplikan antara dua fasa. Salah satu fasa tinggal tetap dalam sistem, dan dinamakan fasa diam atau stasioner. Fasa lainnya bergerak melalui pori-pori atau melewati permukaan fasa stasioner, fasa ini dinamankan fasa gerak atau fasa mobil. Gerakan fasa mobil melibatkan migrasi diferensial komponen-komponen dalam cuplikan.
2. Jenis-jenis kromatografi, pertama berdasarkan perbedaan teknik pengerjaan, dikenal kromatografi elusi, partisi dan pendesakan. Kedua, berdasarkan jenis fasa yang dipakai (mobil-stasioner), yaitu a) kromatografi gas-cair b) kromatografi gas-padat, c) kromatografi cair-cair, d) kromatografi cair-padat. Umumnya metoda kromatografi digolongkan sebagian berdasarkan jenis fasa yang dipakai dan sebagian lagi berdasarkan mekanisme distribusi fasa. Dengan demikian dikenal : Kromatografi cair-padat atau kromatografi adsorpsi, Kromatografi cair-cair atau kromatografi partisi, Kromatografi gas-padat, Kromatografi gas-cair, Kromatografi ion penukar, Kromatografi kertas, Kromatografi lapis tipis, Filtrasi Jel dan Elektroforesis kontinu.
3. Teori dasar kromatografi pertama kali dikembangkan untuk kromatografi cair-cair oleh Martin dan Synge. Jika suatu molekul cuplikan mengikuti proses kromatografi, dapat diamati bahwa dalam fasa diam, molekul ini tidak bergerak, dan baru bergerak maju apabila masuk dalam fasa mobil. Jika keterangan tersebut di atas diterapkan terhadap kromatografi elusi, akan diamati bahwa mula-mula cuplikan yang misalnya terdiri atas komponen A dan B, dilarutkan dalam fasa gerak, kemudian diisikan pada ujung atas kolom yang telah diisi dengan fasa diam. Di tempat awal ini baik A maupun B sudah mendistribusikan diri antara fasa diam dan fasa gerak. Penambahan lebih lanjut fasa gerak akan memaksa cuplikan terlarut bergerak ke bawah sepanjang kolom, setiap kali menemui porsi baru fasa diam A dan B mengalami partisi antara fasa diam dan fasa gerak
4. Koefisien partisi adalah keefektifan kolom kromatografi memisahkan campuran komponen sebagian bergantung pada laju elusi relatif masing-masing komponen, laju ini ditentukan oleh nilai pembanding partisi K = Cs/Cm.
5. Waktu retensi adalah jumlah waktu yang diperlukan sebuah solut untuk keluar dari kolom untuk mencapai detektor.
Faktor kapasitas dimaksudkan untuk menggambarkan laju migrasi solut dalam kolom.
Resolusi adalah menggambarkan ukuran kuantitatif kemampuan kolom untuk memisahkan dua komponen.

6. Elektroforesis adalah ditujukan untuk pengangkutan partikel bermuatan dalam medan elektrik. Ini adalah salah satu bentuk kromatografi, perbedaan dalam laju migrasi dapat dipakai untuk memisahkan protein, polisakarida dan asam-asam nukleik dan sekaligus menentukannya.

I. Daftar Pustaka

Gritter, Roy J, James M. Bobbit and Arthur. E. Schwarting, 1991. Pengantar Kromatografi (terjemahan Kosasih Panduwinata). Bandung ITB.
Hadisoebroto, D.N, 1990. Dasar-Dasar Analisis dan Pemisahan Kimia , Bandung, ITB.
Skoog, D.A, 1980. Principles of Instrumental Analysis. Tokyo: Holf Saunders Editions.
Skoog, D.A, 1982. Fundamental of Analytical Chemistry New York: Holtz Saunders Company.
Soebagio, dkk., 2003. Kimia Analitik II, Malang. Universitas Negeri Malang.